کیت استخراج RNA ویروسی

معرفی و حیطه کاربرد کیت

کیت HumPure Viral RNA Extraction برای استخراج RNA انواع ویروس‌ها با کیفیت بالا از مایعات فاقد سلول بدن از نمونه های انسانی و حیوانی طراحی شده است. کیت حاضر که مبتنی بر فناوری ستون سیلیکا است و با پروتوکلی راحت امکان استخراج همزمان تعداد زیادی نمونه را ممکن می‌سازد. لذا برای آزمایشگاه های تخصصی با تعداد نمونه بالا خصوصا در دوره شیوع پاندمی کووید-19 بسیار مناسب خواهد بود. محصول RNA استخراج شده بوسیله HumPure Viral RNA Extraction از کیفیت بسیار بالایی برخوردار بوده و فاقد پروتئین، نوکلئاز و آلودگی های تداخل کننده برای واکنش های پایین دستی می باشد. RNA استخراج شده بوسیله این کیت را می توان به صورت مستقیم در one-step qPCR و Nucleic acid based assays مورد استفاده قرار داد.

محتویات کیت برای 100 تست

شرایط نگهداری و انتقال محصول

حمل و نقل کیت در دمای محیط انجام می شود. Carrier RNA لیوفلایز را می توان در دمای اتاق نگهداری کرد اما پس از انحلال و آماده سازی باید در دمای منفی بیست درجه سانتیگراد نگهداری شود.

اقدامات احتیاطی و هشدارها

به دلیل استفاده از مواد شیمیایی و اشتعال پذیر، و همچنین حساسیت بالای RNA استخراج شده نسبت به نوکلئازها لازم است حین کار روپوش، دستکش و عینک مناسب استفاده شود و از تماس مواد با بدن جلوگیری به عمل آید.

مواد مورد نیازی که در کیت گنجانده نشده اند

• اتانول ۹۶-۹۹٪
• آنزیم پروتئیناز K (برای استخراج RNA از non-enveloped viruses)
• 1.5 ml RNase Free Collection Tube
• 2 ml microtube

مشخصات نمونه

نمونه های قابل استفاده در این کیت عبارتند از هر گونه مایعات فاقد سلول بدن اعم از سرم یا پلاسمای خون (در حضور مواد ضد انعقاد به غیر از هپارین)، محیط¬های حمل ویروس (VTM) و سرم کلینیکی
حجم پیشنهادی برای هر نمونه 140 ul به ازای 600ul بافر dLyB است. چنانچه حجم نمونه کمتر از این مقدار است با افزودن آب یا سرم کلینیکی آنرا به حجم مورد نظر برسانید.

تهیه بافرهای شستشو

قبل از اولین استفاده مقدار مناسب اتانول 96-100% را مطابق جدول زیر به بافرهای WB1 و WB2 اضافه کرده و خوب هم بزنید تا همگن شود. سپس روی لیبل بطری هر بافر گزینه مربوط به افزوده شدن اتانول را حتما تیک بزنید. بافرهای آماده شده در دمای اتاق نگهداری می شوند.

افزودن Carrier RNA

برای آماده¬سازی Carrier RNA ابتدا 620 ul از بافر EB به میکروتیوب حاوی Carrier RNA لیوفلایز شده اضافه کرده تا محلول با غلظت 1 ug/ul آماده شود. سپس محلول حاصل را در حجم¬های مناسب تقسیم کرده تا از فریز و دفریز شدن مکرر آن جلوگیری شود (مثلا حجم 12-18 ul بطوری که هر الیکوت بیش از سه بار نیاز به فریز و دفریز نداشته باشد). سپس آنها را در دمای -20°C نگهداری کنید. برای هر استخراج ابتدا یک الیکوت از Carrier RNA را از فریزر خارج کرده، حجم 6 ul از آن را به 600 ul بافر dLyB افزوده و سپس 140 ul نمونه ویروسی را به بافر dLyB اضافه کنید.
نکته: این مقدار از Carrier RNA در واکنش¬های پایین دستی تداخلی ایجاد نمی¬کند

مراحل کار

1- در صورت مشاهده کریستال در بافر dLyB آنرا به مدت 5-10 دقیقه در دمای 60 درجه سانتیگراد قرار دهید.
2- مقدار 600 ul بافر dLyB را به همراه 6 ul از Carrier RNA (با غلظت 1ug/ul) به یک میکروتیوب 2 ml اضافه کنید. سپس 140 ul از نمونه ویروسی به آن اضافه کنید. به مدت 10 ثانیه خوب vortex کنید تا مخلوط شود.
(نکته: اگر قصد جداسازی RNA از non-enveloped viruses را دارید حتما حجم 10 ul از محلول حاوی آنزیم پروتئیناز K با غلظت اولیه 20 mg/ml به مخلوط فوق اضافه کنید.)
3- مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود.
4- حجم 600 ul از اتانول 96-100% به مخلوط فوق اضافه کرده و به مدت 10 ثانیه خوب vortex کنید تا مخلوط شود.
نکته: در این مرحله تنها از اتانول استفاده شود. سایر الکل¬ها باعث کاهش بازده و خلوص RNA می شوند.
5- به آرامی حدود 600 ul از محلول فوق را به ستون سیلیکایی منتقل و ستون را بر روی تیوب مربوطه بگذارید. به مدت 1 دقیقه در دور 6000 RCF (~ 7000 RPM) سانتریفیوژ کرده، مایع زیرین را دور ریخته و ستون را مجددا روی تیوب قبلی قرار دهید.
6- مرحله قبل را با باقیمانده محلول حاوی نمونه تکرار کنید.
7- ابتدا دقت کنید الکل به بافرهای شتسشو اضافه شده باشد. سپس 600 ul از بافر WB1 به ستون سیلیکایی اضافه کنید. درب ستون را بسته و حتما چندین بار به خوبی ستون را تکان دهید تا تمام قسمت های آن خوب شسته شود. ستون را روی تیوب قبلی گذاشته و به مدت 1 دقیقه با دور 6000 RCF (~ 7000 RPM) سانتریفیوژ کنید. مایع زیرین را دور ریخته و ستون را مجددا روی همان تیوب قرار دهید.
8- سپس 500 ul بافر WB2 به ستون سیلیکایی اضافه کنید. درب ستون را بسته و و حتما چندین بار به خوبی ستون را تکان دهید تا تمام قسمت¬های آن خوب شسته شود. اینبار ستون را به مدت 3 دقیقه با دور 20000 RCF (~ 15000 RPM) سانتریفیوژ کنید. ستون را به آرامی جدا کرده و بر روی میکروتیوب 1.5 ml تمیز RNase Free قرار دهید.
9- مقدار 60 ul بافر EB که به دمای اتاق رسیده است را با دقت و بدون تماس با دیواره ستون در مرکز فیلتر ریخته و درب ستون را ببندید و به مدت 2-3 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
10- سپس به مدت 1 دقیقه با دور 12000 RCF (~ 10000 RPM) سانتریفیوژ کنید.
نکته: بر حسب مدت زمان مورد نیاز RNA استخراج شده را در دمای -20°C یا -80°C نگهداری کنید.

شرایط منع استفاده

کیت طراحی شده برای استخراج نمونه¬های حاوی سلول مانند بافت، گلبول¬های خونی و باکتری مناسب نمی‌باشد

عیب‌یابی